溫度的影響 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南
柱溫和流動(dòng)相溫度會(huì)以兩種方式影響多肽的分離。
隨著溫度上升,保留值會(huì)略微降低。
但更重要的是,肽對(duì)的相對(duì)保留值(選擇性)取決于溫度。
選擇性隨溫度的變化影響分辨率,且在一系列多肽分離的優(yōu)化中,溫度是重要因素,如蛋白酶水解蛋白質(zhì)期間產(chǎn)生的多肽。
溫度在一系列合成肽分離中的作用如圖23所示。
隨著溫度的增加,多肽保留值略有下降,但更重要的是,肽對(duì)間的分辨率隨著溫度的變化而變化。
因此,在多肽的分離中,控制柱溫和流動(dòng)相溫度很重要。
此外,溫度還是肽分離優(yōu)化的重要變量,尤其是肽圖譜中的分離。
溫度會(huì)顯著影響肽圖譜中多肽的分離,如圖24所示。
該示例為從人生長(zhǎng)激素的胰蛋白酶水解物中分離多肽,增加柱溫不僅影響肽的選擇性,還會(huì)造成洗脫順序的逆轉(zhuǎn)。肽7和8在較高溫度下的分辨率更高。
肽11~13的最佳分離溫度為40°C,溫度提升至60℃會(huì)出現(xiàn)肽11和12的共洗脫峰。
肽14和15的最適分離溫度為20°C,肽15先出峰。
溫度升至40℃時(shí)會(huì)使肽14先于肽15洗脫。
溫度升至60℃時(shí)會(huì)提高肽14和15的分辨率。
在肽圖譜中可以明顯看出柱溫對(duì)分辨率有顯著的影響。
圖23. 多肽保留值隨著溫度的增加而降低。更重要的是,溫度影響相對(duì)保留值或選擇性,進(jìn)而影響分辨率。
條件
色譜柱:C8,2.1 x 150 mm
流動(dòng)相:0~30% 乙腈—0.05% TFA體系,梯度洗脫,60分鐘。
樣品:合成螺旋多肽和非螺旋多肽
圖24. 通常,蛋白水解產(chǎn)生多肽的相對(duì)保留值會(huì)受到溫度的影響。
條件
色譜柱:C8寬孔柱,4.6 x 150 mm
流動(dòng)相:0~60% 乙腈—0.1% TFA體系,混合梯度洗脫,60分鐘。
樣品:人生長(zhǎng)激素的胰蛋白酶水解物
與多肽分辨率相比,蛋白質(zhì)分辨率受溫度的影響較小,但溫度較高時(shí),蛋白質(zhì)的峰形和回收率均有所改善,特別是大分子蛋白或疏水性蛋白。
在環(huán)境溫度下,單克隆抗體圖譜的峰形較差,但當(dāng)溫度升高時(shí),峰形會(huì)有明顯改善(圖25)。
通常在高溫下用色譜法分析大分子蛋白或疏水性蛋白的效果最佳。
圖25.溫度對(duì)反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分析重組單克隆抗體的影響。
條件
色譜柱:C8 寬孔柱,3.5 微米,4.6 x 150 mm
流動(dòng)相:混合液梯度洗脫:20-90% 乙腈-0.1% TFA體系
樣品:重組單克隆抗體