HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：溶解度
我們分析了注射和分離過(guò)程中需要多少緩沖液才能有效緩沖樣品和色譜柱。
與此同時(shí)，還存在一個(gè)問(wèn)題：使用上限是多少呢？
這里應(yīng)注意一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：避免系統(tǒng)中產(chǎn)生緩沖液沉淀。
如果緩沖液在HPLC泵中產(chǎn)生沉淀，則需要大量的清潔工作才能將其清除，還需要更換部件。
而且，如果緩沖液在色譜柱內(nèi)部產(chǎn)生沉淀，則應(yīng)丟棄色譜柱，因?yàn)閹缀鯚o(wú)法從固定相的孔中清洗沉淀的緩沖液。
正如分析人員所熟知的那樣，對(duì)于緩沖液和鹽溶劑來(lái)說(shuō)，乙腈（ACN）的效果比甲醇（MeOH）要差得多，而四氫呋喃（THF）則更差。
表3的數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示了這一點(diǎn)，在pH為7.0時(shí)，可溶性最差的常見(jiàn)緩沖液是磷酸鉀[2]。
當(dāng)有機(jī)物為80%，溶于MeOH中的磷酸鹽濃度為15mM，但在ACN中的濃度只有5mM；在80％THF中幾乎不溶（<5mM）。
在含有50％有機(jī)物的流動(dòng)相中，磷酸鹽可溶于MeOH或ACN（其濃度>50mM），以及THF（25mM）。
也就是說(shuō)，在等度分離時(shí)使用高有機(jī)物（％B）流動(dòng)相或梯度結(jié)束在高％B。
必須注意避免緩沖液產(chǎn)生沉淀。
表3. pH為7.0時(shí)磷酸鉀在普通HPLC溶劑1中的溶解度
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%B |
MeOH |
ACN |
THF |
|
502 |
>50 mM |
>50 mM |
25 mM |
|
60 |
>50 |
45 |
15 |
|
70 |
35 |
20 |
10 |
|
80 |
15 |
5 |
<5 |
|
90 |
5 |
0 |
0 |
表3所示的數(shù)據(jù)適用于本體溶液。
在線混合的效果可能會(huì)更差。無(wú)論是使用高壓混合還是低壓混合HPLC系統(tǒng)，當(dāng)溶劑進(jìn)入混合器時(shí)，A和B溶劑都會(huì)直接充分接觸。
這可能會(huì)產(chǎn)生其它一些意外情況。鑒于這種情況，便需要含有10mM緩沖液的60％ACN流動(dòng)相，這比表3中所示的60％ACN的45mM臨界濃度要低得多。
如果A容器含有25mM緩沖液且B容器含有100％ACN，則A與B以40/60比例混合時(shí)，應(yīng)足以滿足所需的流動(dòng)相。
但是，混合溶劑時(shí)，100％ACN接觸25mM緩沖液后，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。
這可能造成很多問(wèn)題，或者沉淀物也許會(huì)迅速重新溶解，具體取決于設(shè)備的設(shè)計(jì)特點(diǎn)。
所選的鹽也會(huì)使溶解度出現(xiàn)顯著的差異。
如表4所示，在可比條件下，磷酸銨鹽在ACN中比鉀鹽更容易溶解。
醋酸鹽比磷酸鹽更易溶解。通常，考慮到溶解度的差異，最好使用鉀鹽而非鈉鹽。
表4. 不同緩沖液溶于乙腈的溶解度1
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%B |
醋酸銨 pH5.0 |
磷酸銨 pH3.0 |
磷酸鉀 pH 3.0 |
磷酸銨 pH7.0 |
磷酸鉀 pH7.0 |
|
602 |
>50 mM |
>50 mM |
>50 mM |
50 mM |
45 mM |
|
70 |
>50 |
>50 |
>50 |
25 |
20 |
|
80 |
>50 |
35 |
20 |
5 |
0 |
|
90 |
25 |
5 |
0 |
0 |
0 |
1 [2]的數(shù)據(jù)；2 當(dāng)%B更低時(shí)，溶于所有溶劑的濃度>50 mM
